用Solution ELISA 方法检测食蟹猴血清中的抗药抗体（ADA）
摘要
随着生物大分子药物疗法越来越普遍，临床前和临床试验中对生物大分子药物的免疫原性评估（即抗药抗体检测）也面临独特挑战，目前ECL是基于桥联免疫原性检测中最流行的技术平台，但昂贵的设备和试剂仅由一家供应商提供，其实用性受到限制。我们开发并验证了一个ELISA检测方法用来评估食蟹猴血清中的抗曲妥珠抗体。
该方法满足免疫原性分析指导原则的要求，方法灵敏度为10.3 ng/mL( 小于100 ng/mL) ，在未酸解的情况下具有100倍的药物耐受性（曲妥珠单抗 / 抗曲妥珠单抗：10μg/mL / 100ng/mL）；筛选临界值( Screening Cut Point，SCP )为1.30，确证临界值 ( Confirmatory Cut Point，CCP )为40.6%；在3.2~4000ng/mL区间无钩状效应；利用该方法进行SCP- Selectivity及CCP- Selectivity 验证试验结果均为100%通过。
实验方法
方法：桥接免疫原性试验方法
样本类型：食蟹猴血清
样品稀释：1/12
标记抗体：地高辛标记曲妥珠单抗
生物素标记曲妥珠单抗
检测抗体：抗地高辛-HRP
结果
*为离群值
3名分析员在不同日期完成6个分析批，考察19个空白食蟹猴个体血清信号，计算检测值的信噪比( Signal Noise Ratio，SNR )，并用SNR去离群值，正态检验结果 P ≥ 0.05，根据SCP公式( SCP=Mean+ 1.645*SD )计算 SCP 为1.30。
耐药性
Table2. Drμg Tolerance Summary
研究了药物浓度为5, 10, 20μg/mL的曲妥珠单抗下的ADA阳性对照质控品100ng/mL的信号情况，结果显示：该检测方法具有100倍的药物耐受性 ( 曲妥珠单抗 / 抗曲妥珠单抗：10μg/mL / 100ng/mL ) 。
灵敏度
根据上述SCP代入浓度-信噪比标准曲线进行浓度回算结果( 标准曲线的拟合方式为5参数拟合 )，其浓度平均值为方法的灵敏度; 该方法灵敏度为10.3 ng/mL，且在3.2~4000 ng/mL区间无钩状效应。
CCP
Table3. Confirmatory Cut Point Summary
*为离群值
通过对19个空白食蟹猴个体血清在2个不同浓度 ( 0.0，200.0μg/mL )曲妥珠单抗的检测结果进行计算获得Inh%，然后统计排除离群值，P检验通过后根据 CCP = Mean + 2.33*SD 计算得到CCP为40.6%。
选择性
Table4. SCP-Selectivity Summary
Table5. CCP-Selectivity Summary
*为非阴性样本
SCP的验证
通过对16个空白食蟹猴个体血清在2个不同浓度水平 ( 0.0 和 60.0ng/mL ) ADA阳性对照的检测，其中阴性样本在加入阳性对照后有100%都显示阳性结果，证明 SCP设定合理。
CCP的验证
通过对19个空白食蟹猴个体血清含60.0 ng/mLADA阳性对照在曲妥珠单抗药物的2个不同浓度水平 ( 0.0和200.0μg/mL ) 样本进行测定获得Inh%，结果显示：抑制率大于40.6%的阳性样本比例为100%。
实验结论
综上：该方法符合免疫原性分析指导原则的要求，灵敏度较高，药物耐受性好，且所使用的酶标仪检测设备和试验试剂常规不受单一供应商限制，操作可行性强，可以为抗药抗体的检测技术提供一个更加经济实用的选择。